Acest prim caz de manipulare genetică într-o șopârlă a creat un organism model care ar putea ajuta la înțelegerea în continuare a evoluției și dezvoltării reptilelor.
CRISPR-Cas9 sau pur și simplu CRISPR este un unic, rapid și ieftin genă instrument de editare care permite editarea unui genom prin ștergere, adăugare sau modificare ADN-ul. Acronimul CRISPR înseamnă „Clustered Regularly Inter-Spaced Palindromic Repeats”. Acest instrument este simplu și mai precis decât metodele anterioare utilizate pentru editare ADN-ul.
Instrumentul CRISPR-Cas9 injectează organisme în stadiul zigot (o celulă) cu un construct ADN format din (a) enzimă Cas9 care acționează ca „foarfece” și poate tăia sau șterge o parte a ADN-ului, (b) ghidează ARN - o secvență care se potrivește cu gena țintă și astfel ghidează enzima Cas9 către locația țintă. Odată ce o secțiune țintă a ADN-ului este tăiată, mașina de reparare a ADN-ului celulei se va alătura din nou cu catena rămasă și, în acest proces, va reduce la tăcere gena vizată. Sau gena ar putea fi „corectată” prin utilizarea unui nou șablon ADN modificat într-un proces numit reparație direcționată prin omologie. Astfel, instrumentul CRISPR-Cas9 permite modificări genetice prin injectare editarea genelor soluții într-un ou fecundat unicelular. Acest proces provoacă o alterare genetică (mutație) în toate celulele ulterioare care sunt produse, afectând astfel funcția genei.
Deși CRISPR-Cas9 este utilizat în mod obișnuit la multe specii, inclusiv pești, păsări și mamifere, până acum nu a avut succes în manipularea genetică a reptilelor. Acest lucru se datorează în primul rând două bariere. În primul rând, femelele reptile stochează spermatozoizii pe termen lung în oviductul lor, ceea ce face dificilă determinarea momentului exact al fertilizării. În al doilea rând, fiziologia ouălor de reptile are multe caracteristici, cum ar fi coji de ouă flexibile, fragilitatea fără spațiu de aer în interior, ceea ce face dificilă manipularea embrionilor fără a provoca ruptură sau deteriorare.
Într-un articol încărcat pe bioRxiv pe 31 martie 2019, cercetătorii au raportat dezvoltarea și testarea unei modalități de utilizare a CRISPR-Cas9 editarea genelor la reptile pentru prima dată. Specia de reptile aleasă în studiu a fost una tropicală şopârlă denumit Anolis sagrei sau mai frecvent anolul maro care este larg răspândit în Caraibe. Șopârlele din studiu au fost colectate dintr-o regiune sălbatică din Florida, SUA. Această specie este ideală pentru studiu datorită dimensiunii sale miniaturale, sezonului lung de reproducere și timpului mediu relativ scurt între două generații.
Pentru a depăși limitările cu care se confruntă în prezent reptilele, cercetătorii au microinjectat componente CRISPR în ouă imature nefertilizate, în timp ce ouăle erau încă în ovarele femelelor șopârle înainte de fertilizare. Ei au vizat gena tirozinazei care produce o enzimă care controlează pigmentarea pielii la șopârle și dacă această genă este îndepărtată șopârla s-ar naște albinos. Acest fenotip clar de pigmentare a fost motivul pentru a alege gena tirozinazei. Ouăle microinjectate se maturizează apoi în interiorul femelei și sunt ulterior fertilizate în mod natural cu un mascul introdus sau spermatozoizi stocați.
Ca urmare, patru șopârle albinos s-au născut câteva săptămâni mai târziu, confirmând că gena tirozinaza a fost dezactivată și editarea genelor procesul a avut succes. Deoarece descendenții conțineau gena editată de la ambii părinți, a fost clar că componentele CRISPR au rămas active mult mai mult timp în ovocitul imatur al mamei și după fertilizare a mutat genele paterne. Astfel, șopârlele albinos mutante au prezentat tirozinază manipulată în gene moștenite atât de la mamă, cât și de la tată, deoarece albinismul este o trăsătură moștenită de la ambii părinți.
Acesta este primul studiu care a produs în mod eficient reptile modificate genetic. Cercetarea ar putea funcționa într-un mod similar și la alte specii de șopârle, cum ar fi șerpii, pentru care abordările actuale nu au avut succes până acum. Această lucrare ar putea ajuta la înțelegerea în continuare a evoluției și dezvoltării reptilelor.
***
{Acest studiu este în prezent trimis pentru evaluare inter pares. Puteți citi versiunea preliminară făcând clic pe linkul DOI de mai jos în lista surselor citate}
Sursa (s)
Rasys AM și colab. 2019. Preprint. CRISPR-Cas9 Editarea genelor la șopârle prin microinjectare de ovocite nefertilizate. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/591446
